TFF tangenciális áramlású szűrés ultracentrifugálással kombinálva a hatékony kis extracelluláris vezikulák előkészítéséhez

A kis extracelluláris vezikulák (sEV) olyan nanoméretű vezikulák, amelyeket a sejtek választanak ki, amelyek nukleinsavakat, fehérjéket, kis molekulákat és egyéb komponenseket tartalmaznak, és fontos szerepet játszanak a sejtközi kommunikációban. Exosome{1}}típusú kis extracelluláris vezikulák nagy hasonlóságot mutatnak szülősejtjeikkel. A mesterséges nanorészecskékkel összehasonlítva alacsonyabb immun-clearance-t és alacsonyabb citotoxicitást mutatnak, így újszerű jelöltek.in vivo gyógyszerszállító hordozók. Szinte minden sejttípus képes kiválasztani ezeket a vezikulákat, és a gyógyszerhordozóként való alkalmazásukkal kapcsolatos kutatások fokozatosan a laboratóriumi alkalmazásoktól a klinikai alkalmazások felé haladnak. Viszont,A nagyszabású-termelés továbbra is jelentős szűk keresztmetszet.

 

Jelenlegi módszerek az extracelluláris hólyagok izolálására

A jelenlegi extracelluláris vezikula izolálási módszerek közé tartozikultracentrifugálás, sűrűséggradiens centrifugálás, méret{0}}kizárásos kromatográfia (SEC) és polietilénglikolos (PEG) precipitáció.

A PEG precipitáció magas hozamot és egyszerű műveletet kínál, de jelentős nemkívánatos fehérjék általi szennyeződéssel jár. A sűrűséggradiens centrifugálással és a méret-kizárásos kromatográfiával nagy-tisztaságú termékeket lehet előállítani, de hatékonyságuk viszonylag alacsony, és a folyamatok időigényesek. Az ultracentrifugálást széles körben alkalmazzák, de feldolgozási mennyiségét a centrifuga kapacitása korlátozza, ami megnehezíti a méretezést.

 

Tangenciális áramlási szűrés alkalmazása sEV-leválasztáshoz

A tangenciális áramlási szűrést (TFF) már alkalmazták nanorészecskék, például liposzómák és lentivírus vektorok elválasztására. A TFF-ben a betáplálás tangenciálisan folyik át a membrán felületén, ami segít csökkenteni a membrán eltömődését, és megkönnyíti a folyamat méretarányos növelését.

Mivel a kis extracelluláris vezikulák általában tól30-200 nmátmérőben, a0,45 μm-es membránkazettaszelektálhatók a TFF rendszerben a nagyobb fehérjék és vezikulák eltávolítására, míg a300 kDa membránkazettahasználható kis molekulatömegű{0}}fehérjék eltávolítására és a tápközegben lévő kis extracelluláris vezikulák koncentrálására.

 

A nyersanyag jellemzése TFF elválasztás után

A nanorészecskék nyomkövető elemzése (NTA) kimutatta, hogy a részecskeátmérők főként a0-250 nm.

 

 

A transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) vizsgálat azonban nagy mennyiségű szennyező fehérjét mutatott ki, míg extracelluláris vezikulákat nem figyeltek meg. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy egy további downstream tisztítási lépésre volt szükség az extracelluláris vezikulák további tisztításához.

 

A TFF koncentrátum jellemzése 100 kDa ultraszűrés után

A TFF-koncentrátumot tovább dolgoztuk fel a100 kDa ultraszűrő cső.

Az NTA kimutatta, hogy az egy és két ultraszűrés után kapott koncentrátumok részecskeátmérői főként a0-250 nm. Az ultraszűrés kétszeri elvégzése azonban a kapott részecskék számának jelentős csökkenését eredményezte.

A TEM-analízis kimutatta, hogy sem az egyszeri, sem a kétszeri ultraszűrési koncentrátumban nem figyeltek meg vezikulaszerű struktúrákat, miközben jelentős mennyiségű szennyező fehérje maradt.

Ezért,A 100 kDa-os ultraszűrés nem használható hatékonyan a táptalaj tisztítására TFF-koncentráció után.

 

 

Az ultracentrifugálással tisztított TFF-koncentrátum jellemzése

Az NTA kimutatta, hogy a tisztított termékek szemcseátmérői főként a tartományon belül oszlanak meg0-250 nm.

Fontos, hogy a TEM egyértelműen felfedte a hólyagszerű struktúrákat{0}}a különböző látómezőkön. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy miután a táptalajt TFF-fel koncentráltuk,az ultracentrifugálást ezt követően lehet alkalmazni az extracelluláris vezikulák további elválasztására és tisztítására.

 

 

A mezenchimális őssejt kondicionált tápközegből izolált sEV-ek jellemzése ultracentrifugálással kombinált TFF használatával

Az NTA kimutatta, hogy a tisztított termékek szemcseátmérői főként a tartományon belül oszlanak meg0-250 nm.

Hólyagos{0}}szerű struktúrákat figyelt meg a TEM. A Western blot analízis kimutatta az extracelluláris vezikula -asszociált fehérjék pozitív expressziójátCD9, CD63 és ALIXa tisztított extracelluláris vezikulákban.

Ezek az eredmények megerősítették, hogy a tisztított kis extracelluláris vezikulák exoszómákat tartalmaztak, jelezve, hogy ez a módszer alkalmazhatóexoszóma izolálása és extrakciója.

 

 

Következtetés: TFF ultracentrifugálással kombinálva a kiváló{0}}minőségű sEV-előkészítés érdekében

A tanulmány azt bizonyítottaA TFF koncentráció önmagábanjelentős mennyiségű szennyező fehérjét tartalmazó terméket eredményezett, és ezért nem volt elegendő minősített extracelluláris vezikulák előállításához.

Hasonlóképpen, a100 kDa ultraszűrő cső másodlagos tisztításhoznem eredményezett hatékonyan ép hólyagos szerkezeteket.

A TFF-koncentráció és az ezt követő ultracentrifugálásos tisztítás kombinálásával mindkét technika előnyei integrálhatók.kiváló minőségű-kis extracelluláris vezikuláris termékek.

Összehasonlítva a hagyományos ultracentrifugálással, a kombinált eljárás hatékonyan működikcsökkenti a teljes feldolgozási időt és javítja az elválasztás hatékonyságát.

Ebben a munkafolyamatbanA TFF lehetővé teszi a nagy mennyiségű{0}}minták gyors dúsítását, amely a hagyományos ultracentrifugálás korlátait kezeli nagy mennyiségű minta feldolgozásakor. Az ultracentrifugálás ezután mélytisztítást végez a ko-koncentrált fehérjeszennyeződések eltávolítására, miközben segít megőrizni a hólyagok tisztaságát és integritását.

Ezenkívül az eljáráshoz nem szükséges hozzáadniexogén kémiai kicsapó reagensek, segítve a hólyagok biológiai aktivitásának a lehető legnagyobb mértékű megőrzését.

Az ipari fordítás szempontjából ez a folyamat jelentős-növelheti a potenciáltés segíthet megbirkózni az extracelluláris vezikulák nagyszabású-termelésével kapcsolatos kihívások kezelésébengyógyszerszállítás, regeneratív gyógyászat és kapcsolódó termékfejlesztés. Szilárd kísérleti alapot is biztosít a későbbi folyamatoptimalizáláshoz és a kísérleti{1}}léptékű gyártáshoz.

 

Referencia

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha és mások.Módszer kidolgozása kis extracelluláris vezikulák elválasztására ultracentrifugálással kombinált tangenciális áramlási szűréssel. Kínai Biológiai folyóirat, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.