300 kd üreges szálas ultraszűrés: A nagy-hatékonyságú koncentrálási és tisztítási folyamat elemzése a láb-és-láb- és körömfájás O/A vírusa esetén
Sep 03, 2026| Bevezetés
A ragadós száj- és körömfájás (FMD) akut, lázas és rendkívül fertőző állatbetegség, amelyet a ragadós száj- és körömfájás vírusa (FMDV) okoz. Ez a vírus a hasított patás állatokat érinti, több mint 70 fogékony fajjal. Gyorsan terjed és magas a megbetegedési aránya, jellemzően a fő haszonállatokat, például sertéseket, juhokat és szarvasmarhákat érinti, ahol az előfordulás elérheti a 100%-ot. Az FMDV a nemzetségbe tartozikLáb{0}}és-szájvírusa MicroRNAviridae családból. A részecskék gömb alakúak, átmérőjük körülbelül 27-30 nm, ülepedési együtthatójuk 146S az ép vírusrészecskékre. Jelenleg különféle száj- és körömfájás elleni vakcinák állnak rendelkezésre, beleértve az attenuált élő vírusvakcinákat, az élő vírusvektor vakcinákat, az inaktivált vakcinákat, a nukleinsavvakcinákat, a szintetikus peptid vakcinákat és az alegység vakcinákat. Az inaktivált száj- és körömfájás elleni vakcinák általában kevesebb mellékhatással járnak állatokon, a többértékű vakcinák pedig jobb immunizálási hatékonyságot kínálnak, így Kínában a száj- és körömfájás megelőzésének fő pillérei.
Tangenciális áramlású ultraszűrés
Jelenleg a tangenciális áramlású ultraszűrés egy általánosan használt tisztítási és koncentrálási módszer a ragadós száj- és körömfájás elleni multivalens inaktivált vakcinák nagy-gyártásában. Ezzel a módszerrel nemcsak a kívánt koncentrációs tényezőt érjük el, hanem nagy mennyiségű idegen szennyeződést is eltávolítunk. A tangenciális áramlású ultraszűrést elsősorban tisztításra, koncentrálásra és szűrésre (sómentesítésre és pufferpótlásra) használják. Ezen kívül tangenciális áramlású mikroszűréssel fermentlé vagy sejttenyésztő táptalaj derítésére is használható, így helyettesítve a centrifugálást vagy az elsődleges derítést.
A hagyományos függőleges szűrés során a nagy molekulák hajlamosak a membrán felületén aggregálódni, eltömítve a szűrőt. A tangenciális áramlási szűrés azonban lehetővé teszi, hogy az áramlás párhuzamosan haladjon a membránnal, elkerülve ezzel az eltömődési problémát. Tangenciális áramlású szűrés során a membránon áthatoló oldószert és a membrán pórusméreténél kisebb anyagokat permeátumnak nevezzük, míg a pórusméretnél nagyobb anyagokat koncentrátumként tartják vissza. Optimalizált mosási és szűrési folyamatokkal kombinálva különböző méretű molekulák szétválasztása és tisztítása érhető el. Ez a technológia olyan előnyöket kínál, mint az alacsony költség, az enyhe működési feltételek, a kényelmes tisztítás és csere, a nagy membránpermeátum áramlási sebesség és az egyszerű kezelés, így különösen alkalmas a bioaktív anyagok nagy léptékű koncentrálására és tisztítására.
Anyagok és módszerek
Üreges szálas oszlop:A molekulatömeg határértéke 300 kd, a membrán területe 1600 cm².
Anyagok:5,6 liter FMDV O típusú és A típusú FMDV felülúszójából centrifugálás és derítés után.
Folyamat paraméterei:Az ultraszűréssel végzett koncentrálás során a nyíróerőt körülbelül 3000-1 értékre állítottuk be, és a TMP-t úgy szabályoztuk, hogy az ne legyen nagyobb 10 psi-nél. Amikor a koncentrációtényező megközelítette a 11-szeresét, a mintát 6CV pufferoldattal mostuk. Mosás után steril levegőt vezettünk a bevezető csőbe, és a csőben lévő összes koncentrált mintát a mintakoncentráló palackba fecskendeztük. Ezután steril PBS-t adtunk hozzá, hogy a csöveket addig öblítsük, amíg a koncentrált folyadék végső térfogata 500 ml nem lesz, ezáltal javítva a teljes visszanyerési sebességet.
Eredmények és megbeszélés
Ami a kezdeti vírustisztítást illeti, az ultraszűrési koncentráció több mint 90%-os eltávolítási sebességet ér el a szennyeződések, például a vírusokat nem tartalmazó fehérjék esetében. Térfogatot tekintve magas, 10-50-szeres koncentrációt képes elérni, erős támogatást nyújtva a későbbi tisztításhoz. Egy üreges szálas oszlopot választanak ki, amelynek molekulatömeghatára 300 kd. Ez a pórusméret, miközben megtartja a vírus több mint 85%-át, képes eltávolítani a szennyezett fehérjék több mint 90%-át. A membrán területe 1600 cm², és az áteresztőképesség 2-5 ml/cm², ami lehetővé teszi az ultraszűrés koncentrálását hatékony időn belül (2 órán belül). A részletes ultraszűrési koncentrációt és tisztítási adatokat az 1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat: A ragadós száj- és körömfájás antigének (O és A típus) teljes kimutatásának eredményei
| Mintanév | Folyékony takarmány | Térfogat (ml) | 146S-tartalom (ug/ml) | 146S helyreállítási arány (%) | Fehérje koncentráció (ug/ml) | Fehérje eltávolítási arány (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| O-típus | Eredeti megoldás | 5600 | 2.53 | 87.94 | 5040 | 94.38 |
| O-típus | Sűrítmény | 500 | 24.92 | 87.94 | 3170 | 94.38 |
| A-típus | Eredeti megoldás | 5600 | 3.37 | 94.80 | 5980 | 93.55 |
| A-típus | Sűrítmény | 500 | 35.78 | 94.80 | 4318 | 93.55 |
A tisztítási módszer megfontolások
Jelenleg különféle tisztítási módszerek léteznek, de még ha ugyanazt az antigént is alkalmazzák, a tisztítási hatás gyakran nem kielégítő számos okból, beleértve az antigén karakterizálását és a folyamat paramétereit. Például az upstream molekuláris tervezésben vagy a fermentációs tenyésztési rendszerekben bekövetkezett változások megváltoztathatják a vírus molekulaszerkezetét, ami nem kielégítő tisztítási eredményekhez vezethet. A nem megfelelő derítési módszerek növelhetik a nyersanyagköltségeket vagy a heterológ fehérje mennyiségét, növelve a nyomást a későbbi tisztításra. A nem megfelelő ultraszűrési koncentráció, például a különböző ultraszűrő membrán pórusméretek, koncentráció- és elúciós tényezők, bemeneti áramlási sebességek, szűrési sebességek és TMP alacsony antigén-visszanyerési arányt eredményezhet. A kiterjedt gyakorlat azt mutatja, hogy a nem megfelelő tisztítás jelentős mellékhatásokat okozhat az állatokban az immunizálás után, ami akár halálhoz is vezethet.
Következtetés:Ez a tanulmány azt mutatja, hogy tangenciális áramlási folyamatokban a megfelelő membrán pórusméret (300 kd), mosási arány, bemeneti áramlási sebesség és TMP megválasztásával mind a magas visszanyerési sebesség, mind a maximális szennyeződés eltávolítás biztosítható.