Kísérleti alkalmazások és hibaelhárítási megoldások ultraszűrő centrifugálcsövekhez

Az ultraszűrő centrifugálcső egy általánosan használt membránszűrő berendezés a laboratóriumban. Alapeleme egy ultraszűrő membrán, amely meghatározott molekulatömeg-határértékkel rendelkezik. A szokásos ultraszűrő membrán anyagok közé tartozik a poliéterszulfon (PES) és a regenerált cellulóz (RC). Az ultraszűrő centrifugálcső működési elve az, hogy centrifugális erőt és molekula{3}}méret-alapú szitálást használnak, hogy kis molekulákat hajtsanak át az ultraszűrő membránon, ezáltal lehetővé téve a biomakromolekulák, például fehérjék és nukleinsavak gyors koncentrálását, sótalanítását, puffercseréjét vagy tisztítását és elválasztását.

 

MWCO kiválasztása

Fehérje	Ajánlott MWCO	Ajánlott centrifugálási idő
6–20 kDa	3 kDa	40 perc
20-30 kDa	5 kDa	30 perc
30–60 kDa	10 kDa	20 perc
60-100 kDa	30 kDa	20 perc
100-200 kDa	50 kDa	15 perc
200–600 kDa	100 kDa	15 perc
>600 kDa	300 kDa	15 perc
Egy- vagy kettős-szálú nukleinsavmolekulák	Ajánlott MWCO	Ajánlott centrifugálási idő
137–1159 bp	30 kDa / 100 kDa	10 perc (fix-szögű rotor, 5000 × g)
Nanogyöngyök	Ajánlott MWCO	Ajánlott centrifugálási idő
1,5-2 nm	3 kDa	40 perc
2-3 nm	5 kDa	30 perc
3-5 nm	10 kDa	20 perc
5-7 nm	30 kDa	20 perc
7-10 nm	50 kDa	15 perc
10-30 nm	100 kDa	15 perc
>30 nm	300 kDa	15 perc

 

A fehérjékhez olyan membrán MWCO kiválasztása javasolt, amely 2-6-szor kisebb, mint a célfehérje molekulatömege. Ha az áramlási sebességet is figyelembe vesszük, akkor az MWCO membrán használata javasolt ennél a 2×–6×-os tartománynál.

 

Alkalmazási eset (DNS a Shed Cellsből)

A hagyományos módszerhez egy 2,5 cm × 2 cm-es gézdarabot vágtak, kis térfogatú rendszerben lizáltak, és közvetlenül megtisztították a műszerrel. A koncentrálási módszernél a gézmintavételi területet megdupláztuk. A lízis után az emésztési felülúszót egy 100 kDa-os ultraszűrő centrifugális csőbe vittük át, 10 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással betöményítettük, fordított centrifugálással kinyertük, majd DNS-extrakciónak vetettük alá egy teljesen automatizált nukleinsavtisztító műszerrel. Az elúciós térfogatot egyenletesen 40 μL-re állítottuk be, hogy biztosítsuk, hogy a két csoport kezdeti sejtszintje lényegében összehasonlítható legyen.

 

A kvantitatív vizsgálatok azt mutatták, hogy az átlagos DNS-koncentráció 0,099 ± 0,041 ng/μL volt a hagyományos módszernél és 0,193 ± 0,068 ng/μL a koncentrációs módszernél. A két csoport közötti különbség statisztikailag szignifikáns volt (P < 0,01). A betöményítési módszerrel kapott teljes DNS-hozam 1,95-szöröse volt a hagyományos módszernek, ami azt mutatja, hogy az ultraszűrési koncentrálási lépés szinte nem okozott veszteséget a teljes DNS-ben. A két csoport Ct értéke 27,64 ± 0,39 és 27,58 ± 0,40 volt, P > 0,01, ami azt jelzi, hogy az ultrafiltrációs kezelés nem vezetett be PCR amplifikáció inhibitorokat, és nem zavarta a későbbi amplifikációs reakciókat.

 

Az STR genotipizáláshoz a teljes genotípust minden lókusznál teljes sávok és 200 RFU-nál nagyobb vagy azzal egyenlő átlagos csúcsmagasság határozta meg. A 20 párhuzamos minta közül a hagyományos módszerrel mindössze 14 minta esetében sikerült teljes genotípust meghatározni, míg a koncentrációs módszerrel mind a 20 minta esetében teljes STR genotipizálást sikerült elérni, ami jelentősen javította a nyomkontaktus minták hatékony genotipizálási arányát.

A Guidling Technology ultraszűrő centrifugálcsövek egyszerű működéssel, magas koncentrációs faktorokkal és magas minta-visszanyerési sebességgel rendelkeznek, és széles körben használják a biokémiában, a molekuláris biológiában és más területeken. A Guidling Technology ultraszűrő centrifugálcsövek visszanyerési aránya a feldolgozott anyagtól függően változik, és általában meghaladhatja a 90%-ot.

 

Gyakori hibaelhárítás

Probléma	Lehetséges ok	Megoldás
A koncentrálás során csapadék keletkezik	A koncentráció túl gyors	Csökkentse a centrifugálási sebességet
		Használjon nagyobb molekulatömegű ultraszűrő csövet
		Pipettázzon fel és le a centrifugális csőben, majd centrifugálja újra
	Túl-koncentráció	Javasoljuk, hogy a koncentráció utáni végső fehérjekoncentráció ne haladja meg a 20 mg/ml-t
A vizet nem lehet átszűrni	Az ultraszűrő membrán teljesen kiszárad, a membrán felülete gyengén hidrofób lesz	Nedvesítse meg a membránt alacsony -felületi feszültségű- oldószerrel (pl. végezze el a kezdeti centrifugálást 20%-os vízben lévő etanollal)
A koncentrátumban nincs jelen célfehérje	A fehérjeminta kezdeti koncentrációja túl alacsony (< 25 μg/mL)	Ha a minta koncentrációja alacsony és a térfogata nagy, ismételten töltse be a mintát és centrifugálja
	Helytelen membrán MWCO kiválasztása	A membrán MWCO általában kisebb, mint a célfehérje molekulatömegének kétszerese vagy nagyobb
	A centrifugális erő kívül esik a megadott tartományon	Javasolt centrifugális erő: 3000–5000 × g
	A célfehérje kicsapódott	Állítsa be a fehérje célkoncentrációját a koncentrátumban (állítsa be a koncentrációtényezőt)
		Szabályozza a hőmérsékletet és a pH-t
		Használjon adalékanyagokat
		Állítsa be az ionerősséget
Interferencia lép fel a koncentrált fehérje downstream analízise során	Az ultraszűrő membrán nyomokban glicerint tartalmaz	Elő-öblítse le az ultraszűrő csövet pufferrel és tisztított vízzel. Ha az interferencia továbbra is fennáll, tisztítsa meg 0,1 M NaOH-oldattal, majd öblítse le tisztított vízzel és centrifugálja meg
RNáz szennyeződés	Az ultraszűrő cső nem garantált, hogy RNáz-mentes	Javasoljuk, hogy 0,1%-os DEPC-ben áztassa 37 fokon 2 órán át, hogy teljesen inaktiválja az RNázt; a maradék DEPC tisztított vízzel történő öblítéssel eltávolítható
Endotoxin szennyeződés	A mellékelt ultraszűrő csövek nem estek át endotoxin{0}}eltávolító kezelésen, és az endotoxinok széles körben jelen vannak a természetben	A kísérlet előtt végezzen elő-tisztítást 0,5 M NaOH-oldattal, majd öblítse le tisztított vízzel, hogy eltávolítsa a legtöbb endotoxint.